La inmunohistoquímica (IHQ) gira en torno al mecanismo de llevar la enzima al sitio de un antígeno de interés. La enzima conjugada reacciona con el cromógeno para generar un sustrato coloreado con el fin de que la localización del antígeno sea visible bajo un microscopio de luz.
Los tipos de detección IHQ se diferencian por el método que utilizan para unir la enzima al sitio del antígeno. Un tipo de detección común es la detección con avidina y biotina, que utiliza un anticuerpo secundario biotinilado y avidina o estreptavidina ligada a la enzima para la tinción IHQ.
La avidina es una glicoproteína natural que se encuentra en la albúmina del huevo. La biotina, también conocida como vitamina B7, se encuentra en todas las células vivas.
Juntos, se unen rápidamente, formando uno de los enlaces no covalentes más fuertes de la naturaleza. La afinidad de unión y la extrema estabilidad de la biotina con la avidina y sus homólogos han hecho de la unión avidina-biotina un mecanismo favorecido en las aplicaciones de tinción IHQ durante décadas.
Al comienzo del protocolo de IHQ, se aplica primero un bloqueo de peroxidasa para bloquear la enzima peroxidasa endógena en la muestra.
En el caso de un sistema de detección basado en la biotina, debe aplicarse también un bloqueo de biotina para bloquear cualquier biotina endógena.
Estos dos pasos de bloqueo evitan que la peroxidasa y la biotina presentes en el tejido reaccionen de forma cruzada con el sistema de detección y provoquen una tinción de fondo inespecífica.
A continuación se aplica el anticuerpo primario, seguido de un anticuerpo secundario, en las detecciones basadas en la biotina, este anticuerpo secundario se conjuga con una molécula de biotina en un proceso conocido como "biotinilación".
El secundario biotinilado se une al anticuerpo primario, haciendo que la biotina esté presente y disponible en el sitio del antígeno para que la avidina o sus homólogos se unan a ella.
A continuación, se aplica una avidina u homólogo de avidina ligado a la enzima para que se una a la biotina; actualmente, la estreptavidina homóloga es preferida a la avidina en la detección IHQ.
Al igual que la avidina, la estreptavidina se une a cuatro moléculas de biotina y es muy estable, sin embargo, a diferencia de la avidina, la estreptavidina no está cargada a pH neutro y carece de cadenas laterales de carbohidratos, lo que la hace menos propensa a la tinción de fondo en comparación con la avidina.
Además, la estreptavidina proporciona un aumento significativo de la sensibilidad, quizás como resultado de un menor impedimento estérico.
Por último, se aplica un cromógeno que reacciona con la enzima presente en la detección para generar un sustrato coloreado que puede visualizarse al microscopio.
El sistema de detección Starr Trek y el sistema de detección 4plus de Biocare Medical utilizan la tecnología de tinción con estreptavidina para proporcionar la tinción IHC basada en biotina más limpia y clara posible.
Estas detecciones cuentan con un brazo espaciador largo entre la biotina y el anticuerpo secundario, lo que proporciona un aumento significativo de la sensibilidad cuando se combina con conjugados de estreptavidina.
Tanto el sistema de detección Starr Trek como el 4plus, han sido diseñados para una detección fiable, rentable y basada en biotina, proporcionando un alto nivel de sensibilidad. Estos sistemas de detección pueden utilizarse con anticuerpos primarios de ratón y de conejo y pueden utilizarse con las enzimas peroxidasa o fosfatasa alcalina.
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