Preguntas de sondeo: sondas de ADN, sondas de ARN y sondas de ADNc

Introducción

Las técnicas de hibridación de ácidos nucleicos desempeñan un papel vital en diversas aplicaciones clínicas y de investigación, incluida la identificación de genes, la mutación detección, implicación viral y análisis de expresión génica. Estas técnicas se basan en sondas: fragmentos cortos de ADN o ARN monocatenarios.

Que se unen a secuencias complementarias dentro de una molécula de ácido nucleico objetivo. La unión específica permite la detección y análisis de la secuencia objetivo.

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Tipos de sondas

Una sonda de ADN es una secuencia monocatenaria de ADN que se ha sintetizado a partir de un área específica del genoma para que pueda usarse para buscar por su secuencia complementaria en una muestra. Estas sondas se pueden marcar con etiquetas fluorescentes, etiquetas radiactivas o enzimas para que puedan visualizarse mediante microscopía. Normalmente, hay dos formas de sintetizar una sonda de ADN: utilizando un cromosoma artificial bacteriano (BAC). biblioteca o usar fragmentos de ADN para crear una sonda sintética llamada oligonucleótido.

Una sonda de ARN es una secuencia monocatenaria de ARN que ha sido diseñada para unirse a una secuencia complementaria específica en una muestra.
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Las sondas de ARN pueden apuntar a secuencias de ARN o ADN, lo que las hace útiles en muchas aplicaciones de laboratorio, como la hibridación in situ (ISH), transferencia Northern y transferencia Southern. Las sondas de ARN suelen asociarse estrechamente con su secuencia complementaria en comparación con las sondas de ADN. haciéndolos altamente específicos con mejores relaciones señal­ruido. 

Sólo existe una forma confiable de sintetizar sondas de ARN mediante un proceso llamado en Transcripción in vitro, que utiliza enzimas para copiar una secuencia de ADN deseada en un nucleótido de ARN complementario. Las sondas de ARN también son susceptibles, a la degradación de la RNasa, por lo que un cuidado especial es aún más importante y puede afectar su vida útil.

Una sonda de ADNc (ADN copia o ADN complementario) es una secuencia de ADN o ARN monocatenario que se ha sintetizado a partir de una hebra de ARN mensajero (ARNm) mediante el uso de una enzima conocida como transcriptasa inversa.

Comparten la estabilidad de las sondas de ADN y al mismo tiempo ofrecen la capacidad de apuntar a secuencias de ADN o ARN según el caso de uso. Una de las mayores ventajas del ADNc es la ausencia de intrones en su secuencia vs. sondas de ADN y ARN que contienen tanto exones como intrones en sus secuencias. Esta ausencia de intrones lo hace muy específico y típicamente
Proporciona un producto final muy limpio prácticamente sin ruido ni fondo.

• Los exones son las secciones “codificantes” de secuencias genéticas. Contienen las instrucciones para construir proteínas y finalmente se unen para formar la molécula de ARNm final que ayudará a crear una proteína. Se puede considerar a los exones como las instrucciones para construir una máquina.

• Los intrones son las secciones “no codificantes” de secuencias de genes. Si bien los intrones tienen varias funciones, su función no está directamente relacionada con formación de proteínas, por lo que se eliminan durante un proceso llamado empalme de ARN antes de que el ARNm se utilice para la producción de proteínas. Considerarlas información innecesaria en el manual de instrucciones de su máquina

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‍Ventajas desventajas‍

Ventajas de las sondas de ADN: o Estabilidad: el ADN es más estable que el ARN, lo que hace que las sondas de ADN sean más fáciles de manipular y almacenar. Son menos susceptibles a la degradación por enzimas como RNasas, lo que permite una vida útil más larga y requisitos de manipulación menos estrictos.

Síntesis: las sondas de ADN se pueden sintetizar fácilmente utilizando bibliotecas BAC o sintetizadores de ADN automatizados, lo que ofrece una forma más rápida y sencilla, enfoque rentable en comparación con las sondas de ARN.
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Etiquetado: hay disponible una variedad más amplia de métodos de etiquetado para sondas de ADN, lo que permite a los investigadores elegir el más adecuado, técnica de detección para su experimento.

Desventajas de las sondas de ADN: Menor especificidad: los híbridos ADN­ADN pueden ser menos estables en comparación con los híbridos ARN­ADN. Esto puede provocar un mayor ruido de fondo, y sensibilidad reducida, particularmente cuando se detectan objetivos con baja abundancia.
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Condiciones de hibridación estrictas: las sondas de ADN a menudo requieren condiciones de hibridación más agresivas (temperaturas más altas) para garantizar una unión específica a la secuencia objetivo. Esto puede resultar perjudicial para las muestras de tejido delicadas.

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Ventajas de las sondas de ARN:
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Mayor especificidad: las sondas de ARN forman híbridos de ARN­ADN más estables en comparación con los híbridos de ADN­ADN. Esto se traduce en una mayor especificidad del objetivo y una mejor relación señal­ruido, lo que permite la detección de transcripciones raras o polimorfismos de un solo nucleótido (SNP).

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Temperaturas de hibridación más bajas: las sondas de ARN a menudo se pueden utilizar a temperaturas de hibridación más bajas en comparación con las sondas de ADN. Este es más suave con las muestras de tejido y puede ayudar a preservar su morfología.

Desventajas de las sondas de ARN:
Estabilidad: el ARN es menos estable que el ADN, lo que hace que las sondas de ARN sean más susceptibles a la degradación por las RNasas. Requieren cuidado manipulación, almacenamiento a bajas temperaturas y pueden tener una vida útil más corta.
o Síntesis: la generación de sondas de ARN normalmente implica la transcripción in vitro, que es un paso adicional en comparación con la sonda de ADN, síntesis. Esto puede llevar más tiempo, normalmente tiene un costo más alto y potencialmente menos eficiente.

Ventajas de las sondas de ADNc:
Mayor especificidad: combina la estabilidad del ADN con la capacidad de focalización del ARN.
Estabilidad: Tiene la estabilidad del ADN, no tiene que preocuparse por la RNasa como ocurre con el ARN.
Copia de ARNm: Excluye intrones en su secuencia, lo que hace que este tipo de sonda sea muy limpia de usar.

Desventajas de las sondas de ADNc: o
Síntesis: requiere un paso adicional de transcripción inversa y su generación puede llevar mucho tiempo.

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Conclusión
La selección óptima de la sonda depende de varios factores, entre ellos:

• Secuencia objetivo (ADN o ARN)
• Nivel deseado de sensibilidad y especificidad• Tiempo para sintetizar o fabricar.
• Estabilidad y vida útil

Las sondas de ADN, ARN y ADNc ofrecen ventajas y desventajas únicas. Entendiendo sus propiedades y las demandas específicas
Del experimento, los médicos, los laboratorios clínicos y los investigadores pueden seleccionar la sonda más adecuada para lograr resultados óptimos ensus aplicaciones.

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